寡核苷酸药物（Oligonucleotides，ONs）是由人工化学合成的寡核苷酸单链或双链组成的一类药物，经过碱基互补配对效果于mRNA，搅扰基因的解旋、仿制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，使编码反常的基因丢失功用，然后阻挠“过错”蛋白质的表达，然后发挥基因水平上调控疾病基因转录翻译进程的一起机制。
因为寡核苷酸药物一起的化学结构，体现出较差的成药性：分子量较大、亲水性强、高度负电性、不遵从Lipinski’s准则，而且药代特征也较差、无法经过生物膜，还会有脱靶效应。跟着Mipomersen于2013年取得FDA同意用于医治纯合子型宗族性高胆固醇血症（HoFH）的医治（现已撤市），验证了寡核苷酸药物能够运用于眼科之外的范畴，也敞开了根据寡核苷酸药物的基因医治年代，为基因医治范畴的展开带来了巨大的机会。
一些稀有、疑问疾病，如杜氏肌营养不良、乙型肝炎以及成人遗传性转甲状腺素蛋白（hATTR）淀粉样变性引起的周围神经病变等，选用传统的医治手法无法得到有用的治好，而寡核苷酸药物能够从源头干涉，抵达标本兼治的效果，为患者添加了用药挑选。寡核苷酸药物与传统的以蛋白为靶标的药物比较，更具有特异性和高效性，有望添补以蛋白为靶标的药物医治范畴。跟着技能的前进，适应症已扩展到慢病的医治，比方LEQVIO是2020年EMA同意的小搅扰RNA（siRNA），用于降血脂，一年2针。
本文将从寡核苷酸药物的分类、结构特色、化学润饰和投递体系、获批药物、药代动力学特征、免疫原性研讨、安全性研讨、相关法规/辅导准则、生物剖析战略和实例共享几个方面进行论述。
寡核酸药物包含反义核酸（ASO）、小搅扰RNA（siRNA）、细小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、核酸适配体（aptamer）、核酶（ribozyme）等。其间ASO和siRNA类型的寡核苷酸药物运用广泛。
未经润饰的寡核酸带负电、极性大、水溶性强（在中性和碱性环境下）、不易经过脂质双分子层和血脑屏障等生物膜，散布特性差；安稳性差，在细胞外液中易降解，易被肾脏和肝网状内皮体系（单核吞噬细胞, 肝窦状内皮细胞、库弗氏细胞）铲除；对靶点的亲和力差，易脱靶等特色，所以，需求凭借化学润饰或许递 药体系改善成药性。
化学润饰化学润饰对反抗核酸酶的降解尤为重要,关于反义寡核苷酸的润饰首要根据3个方面（如图1所示）：（1）对磷酸骨架的润饰；（2）对糖的润饰（特别对核糖的2’位润饰）；（3）对碱基的润饰。经过润饰，可前进药物对核酶的抗性，添加与mRNA的结合力，削减毒副效果。现在为止，反义寡核苷酸现已从第一代展开到第三代。 硫代磷酸酯寡聚脱氧核糖核酸是第一代的首要代表，在这一类寡聚核苷酸中，磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子，PS骨架的润饰削减了寡核苷酸的亲水性、添加了对核酸酶降解的反抗力以及添加了其与血浆蛋白结合然后使得寡核酸安稳性添加，削减肾小球滤过到尿液中分泌。PS骨架的改造虽然改善了部分PK特性，使其体系露出添加，然后添加细胞吸取和转运，可是单一的PS骨架润饰不能确保寡核苷酸不被酶降解，而且在高浓度时这种润饰下降了寡核苷酸和靶标的亲和力，使机体产生炎症反响。
为了进一步添加靶标结合亲和力、反抗核酸酶降解、削减促炎症反响，出现了具有糖基润饰的二代寡核苷酸药物。 第二代寡聚核苷酸以硫代反义寡核苷酸序列为中心，在核糖的2羟基换成烷基润饰，2-O-甲基和 2-O-乙基是这类润饰的两个重要成员，还有2氟。 2-O-Me的润饰前进了靶标亲和力、核酸酶降解的反抗力以及削弱PS骨架引起的免疫影响性，2-MOE在反义寡核苷酸药物中运用最多； 而siRNA 广泛运用2-F或许2-O-Me润饰。
第三代以PMO（吗啉）润饰为代表，序列特异性强、细胞内活性高且可猜测、很少或没有非反义活性（按捺细胞粘附、成长，搅扰病毒仿制，影响B细胞和单核细胞产生细胞因子等）、水溶性好、抗核酸酶活性高、本钱低。FDA同意的10个反义寡核苷酸药物中有4个为吗啉代寡核苷酸类型。
虽然化学润饰提升了药物的安稳性，可是一起下降了药物与靶点的亲和效果。此外，药物抵达靶点发挥效果前，会与杂乱的通路中的各种蛋白产生效果，以对靶点按捺靶点基因。也就是说药物抵达靶点发挥效果，不只需求药物具有杰出的安排散布特性、杰出的铲除特性，和相关通路蛋白的彼此效果也是极其重要的要素。
核酸药物除了需求经过化学润饰延伸与靶点的效果时刻、添加与mRNA的结合力外，还可经过投递体系的协助进入靶细胞，然后免于被肾脏分泌和核酸酶降解，削减毒副效果。 关于递药体系，近年来，N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）偶联寡核苷酸药物的运用居多。 比方，分子质量〜14kDa 的双链siRNA因为具有较大分子的体积和亲水性，经细胞吸取有限。 为了添加细胞吸取，siRNA一般衔接靶向配体，比方N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）或包裹在脂质纳米粒中进行靶向投递。 获批的5个siRNA中，其间有4个为经N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）润饰。 此外，以脂质体、与其它带正电荷带多肽、高分子等构成纳米粒、外泌体等为代表的纳米投递体系以及AAV载体也均有运用，如图2所示。 选用脂质体纳米粒制剂作为递药体系的Patisiran可将药物靶向投递至肝脏，做成脂质纳米粒后添加肝细胞对药物的内吞吸取效果。 但Patisiran脂质纳米粒制剂会引起促炎症反响。 所以，直接衔接靶向配体的siRNA递药战略好像更有展开远景。 此外，寻觅靶向肝外安排的配体远景宽广。
得益于曩昔20 年化学和生物技能的展开，一些要害技能难题被霸占，全球迎来核酸类药物研制热潮。从1998年至今，全球共有16个寡核苷酸药物获批上市，其间包含10个ASO、5个siRNA和1个适配体，根本信息如表2所示。
寡核苷酸药物的生物化学和生物物理特性是影响这类药物药代动力学特色的根本要素，不同于化学小分子和单抗药物，具有一起的药代动力学特色，表3汇总了全球获批的寡核苷酸药物的药代动力学特征。
表3 获批的寡核苷酸药物的药代动力学特征[FDA，EMA]（表中数据来历于FDA、EMA，由阳光德美收拾制图）
单克隆抗体药物一般和细胞外的可溶性靶标或许细胞外表的靶标结合发挥医治效果，而寡核苷酸药物有必要进入细胞才干发挥药理效果。 药物与细胞外表的蛋白结合，会从血浆中敏捷铲除，使其直接散布于血管外，被安排吸取，然后，经过安排细胞内吞内化至核内体，继而从前期核内体中开释出来，进入细胞质或细胞核靶向mRNA，发挥药效或产生毒性。 进入安排中的药物会经过核酸内切酶和核酸外切酶代谢为不同尺度的、更小的片段。 完好的或许更小的片段凭借于细胞膜浸透、囊泡开释或许外泌体释道中（如图3所示）。
寡核苷酸药物的细胞内化进程包含“有用途径”和“无效途径”，如图4所示。“有用途径”依靠于非巨噬细胞的胞饮效果和内含体的胞内散布效果，从内含体逃逸出来的药物进入细胞质或细胞核内发挥药理效果；“无效途径”依靠于巨噬细胞的胞饮效果，该途径会导致药物集合在溶酶体中被降解或铲除。进入胞内的大部分药物经吞噬效果经过“无效途径”导致药物集合在溶酶体中被降解或铲除。仅少部分经开释、或被胞质和/或细胞核吸取，终究抵达靶RNA。在内含体中有许多和先天免疫相关的Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）当TLRs辨认进入内含体的药物，或许会引起搅扰素和其它细胞因子的激活，然后产生促炎症反响的副效果。
图4 反义寡核苷酸药物吸取进入细胞膜的有用途径和无效途径示意图 [Geary R S , et al. 2015]
口服吸收较少，须经非肠道途径给药。首要经过皮下或许静脉输注给药，有少数报导经口服给药办法；还能够从玻璃体内或鞘内等部分打针完成部分医治。吸收敏捷快，一般2～6h达峰。
二代ASO血浆PK出现多相消除的药代特色（如图5所示）。药物从循环转运至安排的进程较快，散布半衰期较短，从0.5～3小时，药时曲线上体现为血药浓度敏捷下降，快速散布至安排。静脉给予二代ASO药物药后，血药浓度在给药后4～6小时下降10～20倍，24小时内下降2～4个logs数量级的改动。药物被吸取至安排细胞后，在安排中的处置进程极为缓慢，此刻血药浓度十分低，在安排中消除半衰期可达2周至2个月，体现在药效上是和靶点的效果时刻较长。药物在血浆中的结尾消除半衰期能够代表其在安排中的消除半衰期，反映了安排中药物向血浆室的再散布，即药物从安排细胞向细胞外液和血浆室的缓慢搬运的进程。与血浆散布比较，一般，寡核苷酸药物散布至胞内所需时刻长，使得它们起效较慢，因而PD应对与药物浓度之间一般有一段滞后。
因为寡核酸药物在安排中的半衰期长，一般按周、月乃至按年给药。2020年获批的siRNA lumasiran先是按每月一剂后每三个月一剂，大大增强了患者的依从性。而且，一般寡核苷酸药物靶部位达稳达时刻比较久，估测lumasiran在肝脏达稳达时刻长达3个月。
屡次给药后，药物在体内简直没有积蓄现象，或许首要是因为药物会快速广泛地从血浆散布至安排中，在安排中缓慢产生代谢。寡核苷酸药物抵达体内稳态浓度较慢，药物在安排中抵达稳态时谷浓度才会堆集。安排中药物抵达稳态浓度依靠于给药频次和药物自身需具有较长的安排消除半衰期。比方，安排消除半衰期（能够经过血浆后散布相预算）为2周到4周的药物，血浆谷浓度需求2到4个月才或许抵达稳态（假定没有loading dose的状况下），可选用负荷给药办法，可缩短药物抵达稳态的时刻，可是在负荷期或许会出现剂量约束性毒性，如图6所示。
在必定的剂量规模内，寡核苷酸药物在血浆中呈线性动力学特色，随剂量的进一步添加，出现非线性动力学特色，出现代谢饱满。皮下打针药物峰浓度较静脉打针的峰浓度低，虽然相同剂量的皮下打针和静脉打针的血浆动力学有差异, 但靶器官中的浓度却简直持平。寡核苷酸药物的PK特征和核苷酸的一般理化性质、化学润饰、递药体系、偶联物性质密切相关，大多与核苷酸序列无关，比方2-MOE润饰的几种理化性质附近的反义寡核苷酸药物，它们的PK行为在大鼠、犬、猴、人中较为一起，如图7，图8所示。
寡核苷酸药物经过安排向血浆再散布的进程中，血浆和肝脏的药物浓度一般成相对固定份额。有报导，二代ASOs的后散布血浆药物浓度和肝脏药物浓度比约为1:6000，这一份额在不同种属间坚持一起（如图9所示），提示能够经过检测到的血浆药物浓度，核算药物在肝安排的露出水平。根据安排中药物浓度、谷浓度和血浆后散布浓度的相关性好这一特色，有助于构建PK/PD模型，说明露出-效应联系，制定给药计划。
图9 两种不同序列相同的 2′-MOE嵌合结构体现为不同的肝肾半衰期，具有相同的 肝脏:血浆药物浓度比值，且跟着时刻的改动，比值安稳[Richard S Geary, 2009]
ASOs在不同种属间的露出和铲除率与体重相关（BW，mg/kg），而非体外表积（BSA）。食蟹猴的铲除率可依照体重（mg/kg）1：1估测人的铲除率；啮齿类动物的铲除率比人高5-10倍（mg/kg）（scaling factor 为7），如图8和10所示。比方衔接N-乙酰半乳糖胺链接后增强了肝细胞的靶向性，在临床相关剂量时，猴按体重外推人的铲除率是1：1的联系；假如根据体外表积（BSA）核算，猴的铲除率大约是人铲除率的30%～50%。而鼠的铲除率依照BSA估测人的铲除率更精确一些。选用BW，小鼠的铲除率大概是人铲除率的10倍。
图10后散布相血浆药物谷浓度水平与猴安排中药物水平坚持平衡[Richard S Geary, 2009]
siRNA药物从血浆室快速铲除，血浆结尾半衰期较短（3天，Patisiran）需求经过化学润饰如GalNac-siRNA或许运用脂质体投递，可延伸铲除半衰期可达数周，支撑临床以数周或季度频率给药需求。
体系给药后，寡核苷酸药物可在除中枢神经体系外的各安排广泛散布，首要散布于肝脏、肾脏、脾脏、骨髓和骨骼肌等。 散布到肝安排的细胞类型对错实质性细胞如库普弗细胞（Kupffer cell）和内皮细胞，仅有不到15%散布至肝细胞，而肝细胞占肝全体积的80%，可见，只是根据检测安排中的药物浓度并不能点评靶细胞中的药物水平。
关于寡核苷酸药物的表观散布容积的核算问题，因为是根据血浆散布相的数据进行核算，或许轻视了该数值。因为当药物首要从外周室进行消除时，规范的非房室模型的办法会轻视散布的程度。
充沛了解寡核苷酸药物的血浆蛋白结合率十分必要，因为血浆蛋白结合率关乎药物的安排散布和肾铲除率。含硫代磷酸骨架的药物具有较高的血浆蛋白结合率，达90%；N-乙酰半乳糖胺润饰的ASO与未润饰类似，相同具有高达98%的血浆蛋白结合率。虽然经过化学润饰具有杰出的代谢安稳性，吗啉代ASO药物的血浆蛋白结合率较低，如Eteplirsen的蛋白结合率低至6.1%〜16.5%，但一起，24h内其肾脏分泌铲除率可达60%〜70%。此外，siRNA的蛋白结合率从2.1%到90%不等。血浆蛋白结合率高使得药物防止被肾脏快速铲除，促进安排细胞对药物的吸收。
寡核苷酸药物与血浆蛋白结合是经过非特异性低吸附效果结合于亲水位点，而非极性小分子化学药物一般结合于白蛋白的疏水位点。寡核苷酸药物和化学小分子药物血浆蛋白结合位点的差异，使得两者不太或许因血浆蛋白结合位点的竞赛而引起药物彼此效果。一起，寡核苷酸药物发挥效果下的血浆露出水平为μM水平，远低于血浆蛋白浓度水平，引起血浆蛋白的药物药物彼此效果的或许性较小。
寡核苷酸药物首要经过血浆和安排中的核酸酶，包含核酸内切酶和核酸外切酶，进行广泛而缓慢的代谢。 血浆中首要依托核酸外切酶（特别是3’-外切酶活性），细胞内首要依托核酸内切酶。 核酸内切酶会先将药物裂解成小的核酸片段，然后核酸外切酶从药物的3’和5’端进行水解。 硫代ASO的首要代谢产品为3’端去掉一个碱基，然后核酸外切酶进一步将药物剪切，使其失掉2个碱基，以此类推，如图11所示。 一般，二代ASO的外切酶代谢产品较少，而更多的是经过内切酶裂解掉更短的核苷酸碎片。 代谢产品的生成比较慢，一起消除又比较快，使得其血浆中的露出水平相对较低。 N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）结合的ASO在血浆中具有杰出的安稳性，类似前药。 一旦被吸取进入安排后会开释ASO，3个GalNAc糖链会被溶酶体水解酶（N-acetyl-β-glucosaminidase）一个接着一个水解掉，该进程较快，或许仅产生在几分钟内。 此外，因为种属间DNA和RNA的结构和功用较为保存，核酸酶的功用和底物的特异性也较为保存，所以种属之间代谢产品结构的差异并不大。
不同于小分子药物首要是经过CYP450酶产生代谢，寡核苷酸药物首要经过核酸内切酶和核酸外切酶进行代谢，核酸酶广泛地表达于各种安排脏器。所以，肝功用不全患者一般也较少会引起寡核苷酸药物全体铲除率的改动。因为寡核苷酸药物不太或许是细胞色素P450酶和转运体的底物；一起，这类药物也不会直接按捺或许诱导CYP450，所以，直接根据代谢酶和转运体引起彼此效果的或许性较小。可是也要根据药物的效果机制加以重视，比方ALAS1靶点按捺剂Givosiran会下降肝血红素的含量，然后会下降CYP450酶的效果，所以这个药物会添加CYP1A2/2C9/2C19/2D6/3A4底物的血浆露出。此外，IFN-a、IL-6等细胞因子可调控某些CYP450酶的表达水平。所以，要根据药物的效果机制来全面点评这类药物的彼此效果，以及对联合用药代谢的潜在影响。
寡核苷酸药物的分泌较为缓慢，悉数分泌彻底需求几周到几个月的时刻，首要以原形或小片段办法首要经肾分泌。 不同结构寡核苷酸药物的首要分泌途径和分泌办法不同，如硫代润饰的和2′-O-甲基润饰的寡核苷酸药物分泌物多为3′核酸外切酶的降解产品，原型药较少，首要分泌途径为尿； 吗啉代一般以原型办法经过尿分泌； 硫代润饰的比2′-O-甲基润饰的分泌速率快； 某N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）结合的ASO在动物体内的研讨成果表明，约25%以GalNAc簇的极性代谢产品的办法分泌至尿中，大于70%相对脂溶性的代谢物经过粪便进行分泌； siRNA少部分原性药物经尿分泌，给药后24h内，尿中分泌的量仅占十分少的量，大部分药都被吸取进入安排了。
因为寡核苷酸药物的消除半衰期过长，约束了选用惯例手法展开其物质平衡研讨，临床上也较少展开该类药物的物质平衡研讨。上市寡核苷酸药物中仅2021年FDA同意Casimersen进行了人体物质平衡研讨，成果表明，该药92.1%都是经过尿液进行分泌。此外，有报导显现肾损人群随肾功用的严峻程度铲除率下降，血药浓度升高，可是是短暂性的，不会影响全体的给药计划。需求重视肾损人群的药物的铲除率和血浆露出状况，归纳评判是否需求针对特别人群进行给药计划的调整。
ADA的点评一般是在医治前期进行点评，比方3个月或许更早。ADA的研讨成果表明，在寡核苷酸药物的临床相关剂量下，免疫原性对PK的Cmax和AUC露出影响较小。免疫原性阳性的动物血浆谷浓度水平高于阴性的动物，但血浆露出水平高并没有添加安排的露出，所防止疫原性对PD方针没有影响。所以估测，抗-反义寡核苷酸药物抗体归于结合型抗体，非中和活性的抗体。
根据寡核苷酸药物的效果特色，Oligonucleotide Guidline将寡核苷酸的毒性分为①靶向毒性，为靶点相关的药理学活性扩大所引起的毒性反响；②杂交依靠的脱靶毒性，即与靶序列类似的序列杂交而产生的脱靶效应；③非杂交依靠的脱靶毒性，即不依靠于杂交，由寡核苷酸分子的结构和物理/化学性质所引起的脱靶毒性。
核酸药物直接效果于靶基因，阻断mRNA分子翻译成蛋白质。寡核苷酸药物有许多不同于小分子药物的一起PK特色，相同也有一起的毒副效果。虽然寡核苷酸药物具有不同的结构、不同的给药办法、不同的效果靶点和安排，但仍体现出一些一起的副效果，比方都有打针部位的反响；还有反响是效果于免疫体系产生的副效果，比方头痛、发烧；呼吸体系感染引起的咳嗽；胃肠道体系体现的厌恶、吐逆。其间，比较常见的副效果如头痛、发热、流感样症状、腹痛、厌恶、乏力等，能够经过非处方药的干涉自行缓解。最首要的安全性问题是严峻的肝毒性、肾毒性和过敏反响，如表4，图12所示。特别肾毒性的产生率比较高，所以在选用ASO医治时，检测肾功用尤为要害。假如出现过敏反响，则需求停药。靶向肝脏某些基因的表达会引起ALT和AST升高、以及脂肪肝相关的肝毒性。Mipomersen上市五年后于2019年撤市，首要是因为它的肝毒性。
ASO产生肝毒性首要经过2种或许的机制，一个是杂交依靠的脱靶效应或许RNAse-H1酶依靠性下降引起的脱RNAs靶效应。前者产生在ASOs和与靶标RNA有同源序列非特异RNA互补结合的进程；ASOs的肝毒性或许由后者介导的。
ASO的肝毒性或许与内质网应激有关，然后导致药物性极低密度脂蛋白下降，添加了肝脏脂肪变性（Hepatic steatosis）。肝脏Kupffer细胞和肾脏近端肾小管上皮细胞有高浓度的药物散布时，肝脏会体现添加细胞质空泡构成和激活促炎性通路的产生率。
ASO肾脏毒性的或许机制是药物在肾近曲小管溶酶体中的累积所造成的，这与ASO在细胞外的、细胞外表的或许细胞内的蛋白产生离子彼此效果有关。屡次给药使药物堆集后抵达稳态浓度水平，毒性则决议于药物浓度的凹凸和内涵的ASO积蓄的才干。
寡核苷酸药物的结构特色及药代特色，如水溶性强、高度负电性、血浆内浓度跨度大、血浆后散布相浓度低一级，给生物剖析带来了巨大应战。 在剖析前需求对含寡核苷酸药物的生物样品进行前处理，首要有液液萃取法（LLE）、蛋白酶K消解、固相萃取（SPE）、磁珠杂交提取法。
液液萃取法常用的萃取试剂是苯酚和氯仿。 该法能够在损坏细胞膜开释细胞内的寡核苷酸药物的一起坚持药物的溶解性。 随后参加氯仿分层，一般，上层水层中含有RNA、siRNA和寡核苷酸药物，有机层中含有DNA。 药物详细散布于哪层需根据药物性质。 比方，虽然硫代寡核苷酸药物疏水性更强，可是它依旧散布于水层，除非其疏水性极强的状况下散布于有机层。 润饰较少的siRNA或许miRNA药物也倾向散布于水层。 所以，详细试验时，最好一起剖析水层和有机层，防止不行预见的状况产生。 能够参加促溶剂、金属铲除剂、助溶剂等，可前进办法的提取功率。 LLE法的优势之一是能够确保不丢失代谢产品。
蛋白酶K是一种通用的蛋白酶。 该法经过酶解的办法去除蛋白搅扰。 在消解的进程中需求坚持生理pH和温度。 能够参加二硫苏糖醇损坏蛋白的二硫键，添加蛋白酶K的功率。 氯化胍的参加会使蛋白变性，添加蛋白的降解功率。 在蛋白消解的进程中为了确保寡核苷酸药物的安稳性，能够参加与金属离子络合的EDTA以按捺核酸酶。 该法能够较大程度地下降样品的搬运进程。 搬运次数的添加会非特异性吸附添加，特别对低浓度样品的影响程度较大。 该法能够运用于多种寡核苷酸药物生物样本的制备，回收率达90%。 且该法需求调配其它样品前处理办法，如液液萃取，才干较好地扫除杂蛋白的搅扰。
固相萃取法一般选用弱阴离子交流（WAX，如Clarity OTX cartridge）或许亲水-亲脂填料（如HLB），前者运用酸保存、碱洗脱原理，提取功率较高； 后者根据反相离子对色谱的原理。 一般，寡核苷酸样品上样是在pH值为5.5的缓冲液条件下，先对药物进行强保存。 选用相对强的溶剂，如1:1的pH值为5.5的缓冲液和乙腈或许甲醇去除其它内源性物质的搅扰。 洗脱时pH值为9.5，选用1:1的乙腈和四氢呋喃作为洗脱溶剂（如图13所示）。 SPE的回收率能够抵达60～80%，通量较高。 SPE一般能够和苯酚-氯仿萃取、乙醇沉积联合运用，LLE和SPE两步法对色谱柱较为友爱，且布景信号低。
磁珠法可经过靶向和非靶向两种办法完成样品的别离和制备。 靶向法一般需12～15个碱基、与待测物互补结合的、生物素化的捕获链。 生物素能够与链酶亲和素磁珠结合，以此特异性地别离方针物。 该法的缺陷是无法战胜代谢产品带来的搅扰。 此外，因为该法的特异性，使得其约束制备进程中内标的运用。 一起，该法需求为每个剖析物定制捕获探针，且受限于固相载体的容量，动态规模不如LLE和SPE宽。 示意图如图14所示。 非靶向法选用离子交流磁珠法，通用性更强，样品中需求参加弱酸以最大化坚持磷酸骨架的负电性。 参加非离子外表活性剂能够前进洗刷功率，如吐温； 不行用离子外表活性剂，如十二烷基硫酸纳、Triton X‐100，防止它们与药物竞赛结合磁珠外表。 磁珠法可下降样品的搬运次数，防止非特异性吸附，回收率可达80～95%。 但因为操作进程中需求孵育，整个试验操作耗时达5～6小时。
该法一般选用C18柱，相同能够削减样本的搬运次数，经过在线富集，去除样品中低分子量的搅扰物，直接进质谱剖析。该法能够与SPE法联合运用，以前进办法的挑选性。但该法操作较为杂乱，且需求挑选适宜的C18柱用于待测物的富集。
寡核苷酸药物的剖析办法有许多，不同的剖析技能在定性、定量等不同场景中各有各的优势和缺乏，如表5所示。 QWBA能够快速直观地检测药物在所有安排中的散布状况，成果明晰明晰，但无法区别代谢产品和原型药，检测灵敏度不高，而且样品制备进程十分繁琐，通量低。 HPLC和毛细管电泳技能用于出产质控环节或许是结构表征，灵敏度低、样品制备杂乱，毛细管电泳技能办法的重现性差。 而液质、杂交法、qPCR法在PKPD等药性点评上运用广泛。 液质联用剖析技能具有灵敏度高，检测浓度达pg/mL，线性规模宽（两段线性规模可达上万倍），挑选性高、特异性强（可区别原型药物和代谢产品）等特色； 但存在开发难度大，样品制备耗时长等缺陷。 根据核酸杂交的酶联桥接技能检测灵敏度更高，前处理简略。 但需求要害试剂，线倍）、不能区别代谢物。 qPCR法检测灵敏度最高，但和杂交法相同存在无法区别原型药和代谢产品，而且有时检测原药还会遭到代谢产品的搅扰，还存在特异性和潜在的基质效应影响。 别的，后两种办法需求为每一种待测物规划探针引物，添加了时刻和金钱本钱，而且化学润饰或许会对成果有影响。
一般，关于小于20 mer的寡核苷酸药物选用LC-MS/MS法灵敏度较高，关于大于20 mer的挑选杂交规律灵敏度更有确保，如图15所示。但跟着前处理技能和剖析技能水平的前进，液质联用法逐步成为寡核苷酸药物的PK剖析的干流办法。从1998年至今，FDA和EMA同意的16个寡核苷酸药物中，如图16所示，有7个选用液质联用法、4个选用根据核酸杂交的酶联桥接法、3个选用HPLC法，2个未发表办法；其间，2019年-2022年获批的7个寡核苷酸药物均选用液质联用法；自2018年开端，生物剖析白皮书中就对液质联用法用于寡核苷酸药物的生物剖析进行建议和辅导。2020年白皮书指出：与根据核酸杂交的酶联桥接法比较，液质联用法能够一起定量原型药及其首要代谢产品，检测动态规模宽，需求较少的试剂。下文首要对液质联用法和根据核酸杂交的酶联桥接技能进行论述。
图15 液质联用法和杂交法比较(左）和图16 全球获批上市寡核苷酸药物PK剖析办法汇总（右）
液质联用法，不依靠于引物探针以及特别试剂，下降前期的试剂耗材本钱和时刻的投入，特异性强，具有一起定量原型药物和代谢产品的特色。 面对的应战如： 选用离子对试剂会带来信号按捺，高残留、非特异性吸附等问题，需求对色谱、质谱、样品前处理办法等条件进行全面的优化，需求专业的技能团队树立剖析办法。
HILIC法选用极性固定相，选用反相固定相下运用的极性溶剂作为活动相，如水和乙腈，活动相在固定相上构成水层，首要经过弱的静电彼此效果完成别离，如图17所示。选用乙酸铵或许水和乙腈常用于别离寡核苷酸药物。灵敏度不如离子对色谱法，而且其色谱别离有待前进。但比较于IP-LC法也有一起的优势，离子对试剂会搅扰或许加和至不知道代谢产品，使得不知道代谢产品的结构判定较为杂乱，而HILIC不必离子对试剂，所以关于不知道代谢产品的判定研讨具有明显优势。此外，HILIC法不会产生离子对试剂带来的对仪器的离子按捺效果，对仪器设备较为友爱。
离子交流色谱选用带正电的阴离子交流填料作为固定相，保存机制是根据药物和固定相之间的静电彼此效果，跟着活动相中阴离子浓度的添加，与药物彼此竞赛固定相然后完成别离，如图17所示。典型的活动相是氯化钠，高氯酸钠参加至Tris或许磷酸盐缓冲液中。长处是能够使药物完成十分好的别离，最大的问题是与质谱不兼容。
现在，寡核苷酸的色谱法以离子对反相色谱（IP-LC）运用最为广泛。离子对反相色谱是运用带正电荷的有机碱与寡核苷酸药物构成呈电中性的离子对，然后被反相色谱柱所保存的原理，如图17所示。因为寡核苷酸药物具有较高的亲水骨架和负电性，决议了它需求有离子对试剂的协助才干够在色谱柱上有所保存。离子对试剂是两亲性分子，结构中的一端带电或许具有离子化基团，另一端具有“疏水尾巴”。虽然结构中带电部分存在静电彼此效果，可是当它们构成离子对后即可有用地关闭待测物的带电性。待测物体现为电中性，能够完成在反相色谱柱上的保存，然后完成别离剖析。保存机制较为杂乱，包含静电彼此效果和疏水彼此效果。药物的洗脱取决于离子对试剂烷基链的长度与疏水固定相的彼此效果。此外，药物带的电荷数和二级结构也有影响。
离子对的构成使得疏水性添加，活动相的有机相含量添加，能够前进信号呼应。比方，水相和有机甲醇相中参加TEA和HFIP，使得TEA疏水性增强，溶解性变差，然后使药物在较低浓度TEA存在的状况下具有较好的别离效果；一起，可下降对ESI源的离子按捺效应。此外，离子对试剂的浓度添加，药物的别离效果越好，可是，离子对试剂的运用会产生离子按捺效果，特别对正离子形式。所以，适宜的离子对试剂的浓度，以及适宜HFIP的份额，取得好的峰型、呼应、别离度。不同的核酸类型，优选的离子对试剂和酸性调理剂也会有所不同。离子对试剂的品种、浓度，以及酸性调理剂的份额关于价态散布、保存行为、峰型、呼应、别离度均有影响，均需优化和调理，如图18所示。而且，在母离子和子离子扫描时，需运用离子对试剂，防止难以找到药物的母离子和子离子。
非特异性吸附问题是寡核苷酸药物剖析中遇到的首要问题之一。盛装样品的容器、仪器的管路等能够触摸药物的当地均能够与药物产生非特异性吸附效果。含磷酸基团的寡核苷酸药物易与金属离子经过疏水效果力或许离子交流力产生非特异性吸附，然后导致LCMS剖析时，待测物灵敏度下降，乃至低浓度的峰或许会消失；峰拖尾、峰型变差；高浓度的样品易产生残留，残留一般是由整个流路体系吸附引起的，如自动进样器、管路、色谱柱等部位；还会导致规范曲线线性变差。与药物触摸的容器的甲硅烷化是一种有用的反抗非特异性吸附的手法。在前处理进程中挑选适宜的耗材和试剂，例如低吸附的原料的枪头、离心管、冻存管等。跟着色谱技能的前进，现已出现具有抗吸附才干的仪器设备，比方Waters Premier抗吸附液相体系，比方Waters Premier抗吸附液相体系、如ACQUITY PREMIER Column 抗吸附的色谱柱。此外，药物类型为RNA 的时分或许会被RNase损坏, 所以需求无 RNase容器、枪头或试剂。
虽然MALDI适用于寡核苷酸的离子化，可是关于寡核苷酸药物的磷酸骨架为多聚负离子的特色，ESI负离子形式体现出了更优的成果。所以，关于寡核苷酸药物的剖析常选用ESI源，负离子形式。寡核苷酸药物的磷酸二酯键上都带有1个酸性质子，又因为结构中含有多个核苷酸基团，使得ESI源负离子形式下，出现一系列多种去质子化的分子离子峰[M-nH]n-，体现为多价态散布的特色，如图19所示。多价态散布影响信号呼应，有报导，经过下降带电性使其向低质量轴移动，能够添加信号呼应。别的，阳离子如金属离子易与多聚阴离子骨架加合，涣散离子呼应然后会下降质谱呼应信号。一起，跟着寡核苷酸药物分子量的添加，会严峻丢失质谱呼应。此外，多价态散布和离子加和多特色使图谱变得杂乱，不特征、不利于解析。离子对试剂会改善金属加和，而且，在样品制备进程中参加螯合剂，如EDTA，可改善离子加合，有助于寻觅母离子。而且，EDTA-阳离子复合物不会被色谱保存，很简单被洗脱，不会影响质谱功率。
关于寡核苷酸药物ESI源检测时，质谱要求待测物需出现离子状况，活动相具有较低的粘度、低的外表张力、高的蒸发性、低的离子强度，一起，关于负离子形式下，pH值高利于离子化；而色谱部分则要求具有较低的pH值和较高的外表张力。在抵达好的质谱离子化功率和色谱保存条件之间需求寻求平衡。可选用柱后添加法调理pH值以统筹离子化功率和色谱保存。因为甲醇具有较低的介电常数，常被用作有机相。此外，需求留意防止活动相蒸发导致pH值改动引起的峰位的改动。
因为提取办法的杂乱性，需求内标操控提取和检测进程中存在的变异，首选安稳同位素内标，如34S符号PS骨架。但因为同位素内标不易取得，一般会挑选结构类似物作为内标，一般内标的分子量可大于待测物的分子量，内标的浓度挨近标曲上限为宜，因为高浓度的内标能够占有非特异性吸附位点，下降待测物因为吸附效果带来的丢失。
温度也是液质联用法中一个重要的参数，前进色谱柱的温度能够增强动力学和传导特性，前进色谱的别离，一起能够下降活动相的粘度和外表张力以利于质谱信号呼应。在选用HFIP/TEA离子对体系剖析siRNA时，温度尤为重要。选用高于Tm（melting temperature）值，如45 oC～65 oC，完好的siRNAs会变为正义链和反义链。所以，在样品制备和色谱别离时，都应操控温度低于Tm: 10 oC。
根据核酸杂交的酶联桥接技能（下文简称杂交法）原理是运用碱基互补配对的准则规划能够与药物互补配对的探针，与药物结合构成双链，然后可特异地检测待测物。 杂交试验是选用96孔板，类似于ELISA，但两者试验原理不同。 杂交法为选用待测寡核苷酸的互补链作为捕获探针(immobilization）用于捕获待测物，与待测物相连构成核酸杂交复合物； 检测探针类似于检测抗体（能够符号地高辛），与上述核酸杂交复合物相连，树立桥接体系； 经过与抗地高辛抗体相结合，然后完成检测。 根据杂交的检测法具有灵敏度高、通量高的特色。 一起，杂交试验能够省去生物样品的前处理的环节。 但首要问题是会面对代谢产品的搅扰，会使检测成果存在误差。
杂交试验包含一步杂交法( one-step hybridization/nuclease-based hybridization)、两步杂交法( two-step hybridization)、三明治杂交法(a sandwich hybridization)、双衔接杂交法( dual ligation hybridization assay)和竞赛杂交法(competitive hybridization)，如图20和图21所示。一步杂交/根据核酸酶的杂交法是互补探针一端符号生物素，另一端符号检测标签，与待测物互补杂交。复合物固定于预包被的链霉亲和素微孔板上，与S1核酸酶共孵育，去除未杂交成双链的单链，挑选性地定量原型药物。其间，S1核酸酶的效果不只仅能够前进试验的挑选性，还能够改善规范曲线的线性。一步杂交法无法区别完好的药物和3’端产生代谢的代谢产品，该法会高估原型药物的含量。
两步法的捕获探针3’端符号生物素，5’端具有延伸区域（overhang），待测物-捕获探针复合物被固定于预包被的链霉亲和素包被的微孔板上，具有检测标签的衔接探针经过T4衔接酶与捕获探针的5’端的延伸区域互补结合，未结合的探针被洗去，然后完成待测物的检测。有学者将办法改善防止3’端代谢产品的搅扰，可是依然不能扫除5’端代谢产品搅扰。但实际上，有报导称寡核苷酸药物在血浆中的代谢产品大多数为3’→5´核酸外切酶效果下生成的3’端代谢产品。
三明治杂交法首先是将与待测物3’端互补结合的捕获探针包被在板子上，与待测物5’端互补的检测探针和待测物杂交结合，这个中间体复合物与固定在板子上的捕获探针结合构成检测捕获探针-待测物-检测探针复合物。该法会一起检测3’端和5’端的N-1和N-2的代谢物。
双衔接杂交法能够精确、特异地定量原型药物，不受3’端和5’端代谢产品的搅扰。互补模板探针的5’端和3’端的延伸区域别离与待测物和符号生物素的捕获探针杂交。复合物固定在微孔板上后，经过酶与检测探针衔接构成完好复合物完成检测。该法合作电化学发光ECL检测，会抵达十分高的灵敏度和较宽的线性规模。可是，关于短链探针优化得到适宜的Tm值较为困难。
竞赛杂交法是根据样品中待测物和与待测物具有相同序列的带有检测标签的探针竞赛结合至捕获模板的检测原理。竞赛法能够作为三明治法和衔接法均不适用的第三种挑选。比方，当寡核苷酸药物为12-mer时，检测探针和捕获探针太短无法完成特异地杂交，还有3’端不适用或许太短的状况下，均只能经过竞赛法完成检测。
杂交温度、捕获和检测探针浓度和去污剂四个首要参数会影响办法的灵敏度和精确度。杂交温度应设置低于Tm值。捕获探针和检测探针一般需求优化系列浓度，以挑选最佳反响浓度。去污剂能够下降待测物和血浆蛋白之间的非特异吸附效果，这种非特异吸附效果会导致线性差。检测探针的规划能够根据2个准则，内源性物质不行与捕获探针的5’端的延伸区域序列匹配，能够经过BLAST数据库查询；检测探针和捕获探针中应尽或许少地产生碱基配对，防止影响办法的特异性。
此外，血样中抗凝剂的挑选也是十分重要的问题，肝素会带来剖析上的搅扰，或许因为肝素也为负电性，分子量与寡核苷酸药物附近，水溶性强等，所以应挑选低分子量的抗凝剂如EDTA为宜。
阳光德美凭借其巨细分子PK/PD研讨归纳性渠道的优势，霸占重重困难，成功推进了国内首个自主立异寡核苷酸药物的药代动力学研讨，树立了能够一起检测临床血、尿、粪样品中原型药及其代谢产品的生物剖析办法，并成功将办法运用于寡核苷酸药物临床药代动力学研讨，为II期研讨采血点的调整、剂量的调整供给了科学根据。
图22 典型质谱图和初次（右上）和末次（右下）给药人血浆中原型药及其代谢产品的C-t图（Mean±SD, n=6）
Patisiran是2018年取得FDA同意的siRNA脂质体药物，关于特别制剂，需求有特别的考量，该研讨不只检测了原型药物，还检测了2种新式脂质体部分。 下图是取得的药时曲线，成果表明： 该siRNA药物的血浆-药时曲线出现双相消除的特色，开端出现敏捷下降现象，或许是因为药物快速从循环进入安排，浓度再次升高或许是因为药物从肝脏再散布至血中所造成的。 在给药剂量规模内露出随剂量呈份额添加。 别的，研讨者还选取了一个剂量组检测了未结合的siRNA药物，成果表明，未结合的siRNA药物占总siRNA的量不到0.1%，研讨者以为该脂质体在循环中的比较安稳。
关于如脂质体、胶束等杂乱制剂的生物剖析需求一些特别的对策，才干全面答复药物的PK问题，阳光德美具有丰厚堆集和经历。
近年来，跟着基因医治药物的不断展开，为肿瘤及稀有病患者带来了新的用药挑选。寡核苷酸药物的研讨已有30余年，现在有15种寡核苷酸药物获批上市，但关于寡核苷酸药物结构的润饰、药代特性的优化、投递体系的改善、效果的加强、副效果的下降等问题，仍需不断探求。一起，上述问题的霸占也对寡核苷酸药物的生物剖析范畴提出了更高的要求和应战，等待多样化的渠道技能彼此支撑，质谱、免疫、分子生物学等多学科彼此融合，一起推进寡核苷酸药物的研制进入新的展开时期。
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